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                瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

                發(fā)布時(shí)間: 2024-05-31  點(diǎn)擊次數(shù): 715次

                一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)

                核酸分子是兩性解離分子,在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中,其堿基不解離,而磷酸基團(tuán)全部解離,核酸分子因而帶負(fù)電荷,電泳時(shí)向正極遷移。


                瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來(lái)并經(jīng)糖基化修飾,為一種聚合鏈線性分子,使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì),發(fā)揮分子篩功能,使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異,從而達(dá)到分離的目的。


                因此,目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳,其優(yōu)點(diǎn)如下。


                (1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單,電泳速度快,樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。


                (2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻,含水量大(約占98%-99%),近似自由電泳,樣品擴(kuò)散較自由電流,對(duì)樣品吸附極微,因此電泳圖譜清晰,分析率高,重復(fù)性好。


                (3)瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收,電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。


                (4)電泳后區(qū)帶易染色,樣品極易洗脫,便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保持。


                二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

                瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對(duì)分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型,同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。


                1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系

                (1)DNA分子在凝膠中,DNA 片段遷移距離(遷移率)與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比,因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較,便可測(cè)出未知片段的大小。


                (2)瓊脂脂糖的濃度如下表所示,不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。


                瓊脂糖濃度與DNA分離范圍:

                圖片

                2.核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

                不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直線DNA>開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA


                當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí),環(huán)狀DNA不能進(jìn)入膠中,相對(duì)遷移率為0(Rm=0),而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性狀棒)則可以長(zhǎng)軸方向前進(jìn)(Rm>0),由此可見(jiàn),這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度,但同時(shí),也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。


                三、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法

                1、選擇適合樣品預(yù)期片段大小的瓊脂糖凝膠濃度百分比。將瓊脂糖粉末與用于運(yùn)行凝膠的相同類型的緩沖液(TAE)結(jié)合起來(lái),加熱使混合物融化,避免沸騰。


                2、選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳子,為樣品和marker提供足夠數(shù)量的孔,以及容納每個(gè)待裝樣品數(shù)量的孔容量。


                3、膠凝固后,將凝膠放入電泳儀中,電泳液沒(méi)過(guò)凝膠,根據(jù)加入量的多少,決定混合多少ul的loding buffer,將樣液混合loding buffer用移液槍加入到凝膠中。


                4、蓋上蓋子,確保電極和蓋子的方向正確,注意正負(fù)極,打開(kāi)電泳儀,設(shè)定凝膠運(yùn)行的時(shí)間和電壓,根據(jù)樣品大小確定運(yùn)行時(shí)間。


                四、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)技巧和注意事項(xiàng)

                1、瓊脂糖凝膠溶液配制時(shí)總液體量不宜超過(guò)錐型瓶50%容量。


                2加熱時(shí)可以中途搖動(dòng)搖動(dòng),防止瓊脂糖凝膠凝在錐形瓶底部。


                3注意不要損傷梳底部的凝膠。防止加樣時(shí)樣品漏出。


                4、凝膠濃度越低,分辨的片段越大;凝膠濃度約高,分辨的片段越小;


                5、使用紫外投射儀觀察,紫外光對(duì)DNA分子有損傷作用,不可長(zhǎng)時(shí)間照射。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間以減少紫外光切割DNA。


                6、紫外燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)鏡,以免損傷眼睛。



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