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免疫細胞轉(zhuǎn)染時相關(guān)事項要了解！
發(fā)布時間： 2021-10-06 點擊次數(shù)： 1248次常規(guī)免疫細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類：一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測；后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。免疫細胞轉(zhuǎn)染時的相關(guān)事項：1.細胞密度一般來說，當細胞密度達到60%-80%時進行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率，過低或過高都會影響轉(zhuǎn)染效果。2.細胞狀態(tài)這點非常關(guān)鍵，很多時候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細胞對轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代的細胞系，并在不同次實驗時保持細胞傳代次數(shù)的一致性。盡量選擇無支原體污染的細胞，支原體污染是肉眼看不到的，可用支原體檢測試劑盒進行檢測，確保無支原體污染。3.細胞種類不同細胞種類的細胞在做轉(zhuǎn)染時所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種體系用在所有類型細胞的轉(zhuǎn)染實驗。4.DNA純度在制備高純度DNA時，還需要對DNA進行內(nèi)毒素的去除，內(nèi)毒素的存在會造成細胞毒性，嚴重影響轉(zhuǎn)染效率，現(xiàn)在市面上有很多去除內(nèi)毒素的DNA純化試劑盒可供選擇。5.轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體試劑的毒性大，盡量選用脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑。另外，在大規(guī)模使用前，需進行轉(zhuǎn)染試劑和核酸優(yōu)比例的摸索。
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